论文简介：
硕士论文-虾青素合成酶基因转化花生的研究，共64页，29581字
摘 要
虾青素是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，具有广泛的应用价值。红球藻中
虾青素的合成是在一系列酶的作用下合成的，其中β-胡萝卜素酮化酶（CrtW）和β-胡
萝卜素羟化酶（CrtZ）是合成过程的两个关键酶。本试验以花育21号、22号、23号、
24号子叶为外植体，用含有载体pCAMBIA1301的农杆菌EHA105侵染转化。通过对转化
植株的PCR扩增验证，β-胡萝卜素酮化酶（CrtW）基因和β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）
基因转入花生基因组。实验中对影响花生再生体系和转化体系的因素进行了优化，主要
内容如下：
1．高频再生体系的建立一直是花生转基因的主要影响因素，而基因型又是影响花
生再生的主要因素。本试验以花育21、22、23、24为实验材料，以子叶为外植体诱导
丛生芽，建立了适应多基因型的高频再生体系。在6-BA为20?M、2，4—D为7.5?M的
条件下花生子叶丛生芽平均再生率为90.67﹪。
2．抗生素对花生再生体系有显著影响，通过本试验研究发现，头孢霉素使用浓度
为500mg/L,卡那霉素在筛选培养基使用浓度为100mg/L，在生根培养基中使用浓度为
40mg/L。
3．影响遗传转化的因素主要探讨了共培养时间和菌液浓度。其中预培养2-3天、
菌液浓度OD600=0.5时转化效果最好。
4．对抗性植株的PCR检测初步证明，CrtW和CrtZ基因已整合进花生基因组中。目
前，已经获得转基因植株，为今后进一步将植物基因工程技术应用于花生遗传改良打下
了基础。
关键词：花生，β-胡萝卜素酮化酶基因，β-胡萝卜素羟化酶基因，农杆菌，遗传转化，
再生体系，虾青素
目 录
摘 要 . 1
Abstract ....... 2
前言 ... 3
1 研究目的和意义 .. 3
2 文献综述 ... 4
2.1 虾青素研究现状 .......... 4
2.2 花生植株再生和转化技术研究....... 11
材料与方法 19
1 实验材料 . 19
1.1 植物材料 ......... 19
1.2 供试菌株与质粒 ........ 19
1.3 实验试剂和仪器 ........ 20
1.4 培养基 .. 20
2 实验方法 . 20
2.1 花生高效再生体系的建立 ... 20
2.1.1 花育 21、23 不同激素浓度处理.. 20
2.1.2 不同花生基因型在最佳浓度激素配比上的丛生芽诱导情况 20
2.1.3 组织培养过程 ......... 21
2.2 抗生素对花生再生体系的影响....... 21
2.2.1 除菌剂对农杆菌的抑制 .... 21
2.2.2 头孢霉素对花生子叶分化再生的影响... 21
2.2.3 卡那霉素对花生子叶分化再生的影响... 21
2.2.4 卡那霉素对再生苗生根的影响.... 21
2.3 PCR 鉴定质粒载体所含目的基因 .. 21
2.4 农杆菌介导花生遗传转化 ... 23
2.5 转化苗的生根 . 24
2.6 抗性苗的 PCR 检测... 24
结果与分析 27
1 花生高效再生体系的建立 ...... 27
1.1 不同激素浓度丛生芽诱导结果....... 27
1.2 激素对花育 21 丛生芽诱导率的影响........ 27
1.3 激素水平对花育 23 丛生芽诱导影响........ 29
1.4 不同基因型分化结果 30
1.5 组织培养过程 . 30
2 抗生素对再生体系的影响 ...... 32
2.1 除菌剂对农杆菌的抑制 ....... 32
2.2 头孢霉素对再生体系的影响 .......... 33
2.3 卡那霉素对丛生芽影响 ....... 33
2.4 卡那霉素对再生苗生根影响 .......... 34
3 转化载体的 PCR 鉴定结果 ..... 34
4 农杆菌介导花生遗传转化 ...... 35
4.1 农杆菌生长曲线的测定 ....... 35
4.2 农杆菌侵染浓度与共培养时间对遗传转化的影响结果 35
4.3 不同基因型对遗传转化效率的影响.......... 36
5 PCR 鉴定结果.... 37
讨论 . 39
1 花生再生体系的建立 ... 39
1.1 外植体的选择 . 39
1.2 激素对外植体的影响 39
2 影响转化的因素 39
3 外植体的抑菌 .... 40
4 转化体的选择培养 ....... 40
5 转化苗的移栽 .... 41
结论 . 42
参考文献 .... 43
附录 . 48
致谢 . 53

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