论文简介：
硕士论文-整合WSSV囊膜蛋白VP37的假型HIV病毒的构建与功能研究，共68页，28804字
摘 要
对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)自从 90 年代初以来给全球
虾类养殖业带来严重的危害，目前已成为海水养殖中主要的病原之一，引起越来越多的
关注。自 WSSV 基因组全序列公布以来，各国对于对虾白斑综合征(White spot syndrome,
WSS)的研究焦点现已逐渐集中到蛋白质组学方向，研究该病毒基因产物的功能，弄清
病毒各蛋白在病毒粒子上的定位以及在病毒感染宿主细胞的过程中所起的作用，借此希
望能够找到有效的预防和治疗对虾白斑综合征的方法途径和技术手段。由于假型病毒
(pseudotyped virus)的细胞嗜性和感染过程和真病毒相似，可以模拟病毒早期的感染过
程，而且携带报告基因的假型病毒可以方便快速的进行各种分析和检测，因此假型病毒
不仅能够更好的研究病毒与宿主细胞之间的相互关系，鉴定病毒受体，还可以用于筛选
抗病毒药物、评价中和抗体效价、评价疫苗免疫的效果等。所以本论文选择了携带有绿
色荧光蛋白 EGFP 报告基因的真核表达载体 pEGFP-N1 与 WSSV 的一种囊膜蛋白 VP37
融合表达，并采用 HIV 假型病毒构建系统将绿色荧光蛋白 EGFP 和蛋白 VP37 整合在假
型病毒的外膜蛋白上，构建出整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假型 HIV 病毒，并对其进
行验证和功能分析。
本研究主要包括 3 部分内容：用慢病毒表达系统构建整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的
假型 HIV 病毒；对构建出的整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假型 HIV 病毒进行电镜和分
子生物学检测；用整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假型 HIV 病毒对 WSSV 粒子侵染虾细
胞进行中和保护实验。
本论文取得的主要研究结果如下：
1 根据 GenBank 中 WSSV 的 vp37 基因序列(NO. EF661845.1)，使用 Primer Premier
5.0 生物软件设计了一对引物，并利用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)
从由本实验室分离保存的 WSSV 粒子中扩增出目的基因片段，经测序鉴定后，将目的片
段与真核表达载体 pEGFP-N1 进行连接，转化到大肠杆菌 TOP10 感受态中，经菌落 PCR
鉴定的阳性单克隆进行了扩大培养，提取质粒，对其进行了双酶切鉴定，然后测序鉴定
了双酶切产物，成功构建重组表达质粒 pEGFP-N1-vp37。
2 重组表达质粒 pEGFP-N1-vp37 与质粒 PNL4-3 共转染人胚肾细胞 293T，转染 48h
后，分别收集细胞和培养液，经处理反复冻融等处理后假病毒液保存到－80℃。取部分
假病毒进行电镜和荧光显微镜观察、SDS-PAGE 和 Western-blot 检测，证实了整合 WSSV
囊膜蛋白 VP37 的假型 HIV 病毒的成功构建。
3 用改良 2×L15 培养液对日本囊对虾(Penaeus japonicus)的血淋巴细胞进行原代培
养，培养 24h 时用假病毒液处理虾细胞，继续培养 30min 后再用 WSSV 粒子处理，然
后继续培养 24h，DAPI 染色后荧光显微镜观察细胞的形态和活细胞的数量，确定了整
合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假型 HIV 病毒可以和日本囊对虾血淋巴细胞结合，并能抑
制 WSSV 对虾细胞的侵染。
关键词：WSSV；VP37；质粒构建；细胞转染；DAPI
目 录
摘 要 .....I
ABSTRACT.III
英文缩写词表 ........V
1 前言 .....1
1.1 对虾白斑综合征病毒(WSSV)的研究背景..1
1.1.1 WSSV 的发现、命名和分类 ..1
1.1.2 WSSV 的流行病学 1
1.1.3 增殖 WSSV 的动物模型.....2
1.2 WSSV 的基因组学和蛋白质组学的研究 ...2
1.2.1 WSSV 的基因组学 2
1.2.2 WSSV 的蛋白质组学 .......3
1.3 假型病毒的研究进展 ........3
1.3.1 假型病毒的特性..4
1.3.2 假型病毒载体的类型 .......4
1.3.3 假型病毒的应用..5
2 真核表达载体 PEGFP-N1-VP37 的构建 ....7
2.1 试验材料和方法....7
2.1.1 试验材料和主要仪器 .......7
2.1.2 方法 .11
2.2 结果 ..17
2.2.1 质粒 PEGFP-N1 的提取和 VP37 基因的扩增 .....17
2.2.2 PEGFP-N1 和 VP37 的双酶切 ........18
2.2.3 重组质粒 PEGFP-N1-VP37 的提取 ....19
2.2.4 重组质粒的 PCR 检测、双酶切鉴定与 DNA 测序 .19
2.3 讨论 ..25
3 细胞培养 27
3.1 试验材料和方法 ..27
3.1.1 试验材料 ......27
3.1.2 方法 .28
3.2 结果 ..29
3.2.1 PCR 检测结果...29
3.2.2 对虾血淋巴细胞的原代培养 .30
3.2.3 293T 细胞的传代培养......31
3.3 讨论 ..32
4 整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假型 HIV 病毒的构建和验证 .....34
4.1 试验材料和方法 ..34
4.1.1 试验材料 .......34
4.1.2 方法 .37
4.2 结果 ..40
4.2.1 质粒 PEGFP-N1-VP37 和 PNL4-3 的扩增及浓度测定 .......40
4.2.2 电镜观察和荧光观察结果 ..41
4.2.3 12% TRICINE SDS-PAGE 电泳和 WESTERN-BLOT 鉴定 ...42
4.3 讨论 ..43
5 整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假性 HIV 病毒功能的初步探讨 ...45
5.1 试验材料和方法 ..45
5.1.1 试验材料 .......45
5.1.2 方法 .46
5.2 结果 ..46
5.2.1 整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假性 HIV 病毒与对虾细胞的结合........46
5.2.2 整合 WSSV 囊膜蛋白 VP37 的假性 HIV 病毒对病毒的中和作用 ........47
5.3 讨论 ..48
6 结论 ....49
参考文献 ..50
致谢 ...55

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