(毕业论文 页数:4 字数:4089)[摘 要] 概述大豆抗虫基因及其修饰、载体的构建、遗传转化的方法、转基因植株后代抗性表现等方面的研究进展。
关键词 大豆; 杀虫基因; 遗传转化; 抗虫基因工程
目录
1 抗虫基因及其修饰
2 抗虫基因载体的构建
3 抗虫基因导入方法
4 大豆抗虫基因工程研究现状
大豆生育期间受害虫侵害严重, 常给大豆生产造成巨大损失。大量喷施化学杀虫剂,不仅会增强害虫的抗药性, 使益虫及其它动物区系遭受破坏, 而且严重污染环境, 提高生产成本, 破坏生态平衡。常规育种及栽培技术由于育种年限长, 遗传资源有限, 抗虫机制不甚明了, 以及害虫新生物型的发展导致抗性不稳定等原因已有一定的局限性, 收效不大。八十年代迅速崛起的植物基因工程技术为大豆抗虫育种开辟了新的途径, 已引起了许多育种工作者的关注。本文拟就大豆抗虫基因工程方面研究的进展作一综述。
1 抗虫基因及其修饰
1. 1 B t 晶体蛋白毒素基因
苏云金芽孢杆菌(Bacillu s thu ringien sis 简称B t) 是一种能产生杀虫晶体蛋白的土壤杆菌, 在形成芽孢时可生产一种不溶性的伴孢晶体蛋白—D内毒素(D2endo tox in) , 其量约占孢重30% 左右。它通常由600- 1200 个氨基酸组成的一种多肽前毒素。B t 晶体蛋白的杀虫机理是该蛋白与昆虫中肠道上皮纹缘细胞(b ru shbo rder m em b rance) 上的受体位点结合, 引起并破坏纹缘膜细胞渗透压平衡, 使细胞裂解, 杀昆虫(A ron son 等, 1986)。B t 毒蛋白的杀虫性非常专一，其中两个变种(B t aizaw ai 7- 29 和B t ku rstak iHD- 1) 为杀鳞翅目昆虫的优良菌种(Row e, 1987)。1981 年,W h itely 克隆了B t 毒蛋白基因crylA (b)。至今, 人们已从B t 中克隆出50 多个毒素基因(Barton andM iller, 1993)。通过克隆技术已确定B t 毒蛋白基因位于30- 150MD 大小不同的质粒上, 其中毒性区间位于该序列N 末端29- 607 个编码区(V acek等, 1987)。A dang 等(1985) 首次报道了转B t 毒蛋白基因的烟草植株, 2 种转基因植株都能有效地抵抗一龄烟草天蛾, 随后研究人员先后把B t 基因转到棉花、番茄、大豆等植物中。但野生型B t 毒蛋白基因在高等植物体内表达量低, 抗虫效果不理想(Benedict 等, 1992)。M u rry 等( 1991) 认为, 与高等植物结构基因正常的DNA 序列相比, B t 基因含有较多的A T 碱基和A TTTA 重复序列。A T 富含区在高等植物中被认为是不能表达的内含子(Goodal 等,1989) ,A TTTA 重复序列在高等植物的转录翻译系统中会影响mRNA 的稳定性(Shaw 等,1986) , 二者都不能在高等植物中进行编码(Kunk le, 1985)。为此,Mon san to 公司的科技人员从两方面入手来解决B t 晶体蛋白表达量低的难题: 一方面改进T i 质粒转化载体的启动子, 在原先基础上加入重复的强化表达区(dup licated enhanced region)。通过启动子的改造, 野生型基因的表达水平可提高5- 10 倍(Perlak 等, 1990)。另一方面, 他们采用人工合成的方法合成了一条全新的DNA 序列。与野生型B t 毒蛋白相比, 它改变了390 个碱基对, 涉及60% 的密码子, 使GC 含量增加到49% , 且不含A TTTA 重复序列, 这种完全修饰的B t 毒蛋白基因导入植物后, 使植物体内的D- 内毒素含量比野生型提高了100 倍, 并表现较强的杀虫效果(Perlak 等, 1991)。
1. 2 豇豆胰蛋白酶抑制剂
植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质(Ryan, 1989)。与苏云金杆菌毒蛋白相比,具有抗虫谱广, 对人无副作用以及害虫不易产生耐受性等优点(Gatehou se, 1988)。目前已从豇豆、大豆、番茄、马铃薯、大麦等植物中分离纯化出多种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因或cDNA。经过多年的深入研究, 比较了不同来源的各种蛋白酶抑制剂, 发现豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea t ryp sin inh ib ito r, 简称CpT i) 抗虫效果最为理想。这是因为CpT i 的作用部位是酶活中心, 除非其消化系统主要生理生化过程都发生变化, 否则害虫几乎不可能通过突变的方式诱发抗性, 所以CpT i 所介导的抗性是比较稳定的。豇豆胰蛋白酶抑制剂是由设在尼日利亚的国际热带作物研究所( IITA ) 从几千份豇豆资源材料中筛选得到的一份抗豆象蝉材料- TV u2027中得到的。它是由约80 个氨基酸组成的多肽, 其产物可抑制昆虫消化道中的消化酶, 使昆虫取食后不能演化吸收营养物质而饿。H ilder 等(1987) 首先将豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入烟草, 获得能毒杀烟芽夜蛾的转基因烟草。Parro t t 等(1994) 已将CpT i 转入大豆, 但无详细报导。
2 抗虫基因载体的构建
分离得到的抗虫基因一般不能直接使用, 必须对其进行分子重组和修饰, 把目的基因、启动子、报告基因、终止子及加强子等整合到合适的载体上(一般采用农杆菌T i 质粒) , 其中关键是启动子。目前大豆上所采用的启动子多为花椰菜花叶病毒GaMV 35S 启动子、NO S 启动子、光诱导启动子和B- 云扁豆蛋白启动子等。常用的报告基因有氯霉素已酰转移酶(CA T )、新霉素磷酸转移酶(N PT - Ê ) 和B- 萄葡苷酸酶(GU S) 基因。
3 抗虫基因导入方法
3. 1 农杆菌质粒介导法
土壤农杆菌(A grobacterium ) 有两种: 根癌农杆菌(A. tum efacien s) 和发根农杆菌(A. rih izogenes) , 均能向植物细胞转移其质粒上的一段DNA (T - DNA ) 片段, 所导入的片段(T - DNA ) 可整合到植物细胞核基因组中, 并能稳定遗传下。目前, 大豆等作物的转基因工程大多采用农杆菌质粒介导法进行基因转移, 其中以根癌农杆菌T i 质粒更为普遍(贾士荣等, 1992)。其方法是将植物外植体浸泡在农杆菌溶液中, 使农杆菌侵染植物组织, 然后把外植体取出冲净置于含抗菌素的选择培养基上培养, 诱导外植体再生植株, 由于目的基因同时连接有报告基因(如N PT - Ê 等) , 凡能在选择培养基上出愈者, 就表明目的基因被整合到植物细胞核基因组中。农杆菌介导法的优点在于可靠性强、效率高、但只有外植体能再生的双子叶植物才能采用。
3. 2 微弹射击法
微弹射击法, 又称基因枪法, 是由康奈尔大学Kleim 等(1987) 发明的外源基因直接导入植物细胞的方法。该方法是将带有目的基因的载体裹在金属(钨) 微粒上, 再用金属微弹加速轰击受体组织, 金属微弹到离受体细胞一定距离的金属网屏受阻, 而把微粒连同基因载体打入受体组织细胞内, 再通过组织培养产生再生植株。该方法的受体不受植物种类、器官等限制, 特别用于农杆菌不能感染的单子叶植物, 但可靠性较差, 转化频率较低。
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