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博士学位论文-Q酮酸加低蛋白饮食抑制肾纤维化的作用及其机制，正文共87页。
【摘要】 慢性肾脏病(CKD)是一种常见肾脏疾病,若未能进行有效治疗,最终将进入终末期肾脏病(ESRD)。肾纤维化是各种病因导致的CKD发展至ESRD阶段的共同途径和主要病理结果。氧化应激、慢性炎症及转化生长因子β(TGF-β)等细胞因子均在其发生发展中发挥重要作用,但其确切发病机制尚不清楚。Kruppel样因子15(KLF15)是一种在体内广泛分布的核转录因子,属于锌指蛋白家族,通过对多种基因的表达调控参与细胞分化、增殖、凋亡等生物学过程。2007年Fisch S等研究表明,KLF15参与调控心脏纤维化的发生,其机制与抑制I型胶原转录和结缔组织生长因子(CTGF)启动子活性有关。肾纤维化的发生与心脏纤维化存在相似机制,但目前尚无KLF15与肾脏纤维化关系的研究,其是否是影响CKD肾纤维化发生及进展的重要因素是本研究的关注方向。限制蛋白饮食是CKD的主要治疗策略之一,可减轻CKD患者氮质血症,延缓肾衰病情进展,但单纯低蛋白血症可能会引起营养不良等问题。目前临床常采用低蛋白加α酮酸治疗CKD患者,α酮酸可提供必需氨基酸并减少氨基氮的摄入,在不增加体内毒素的同时维持一个相对良好的营养状态。但目前仍不清楚低蛋白加α酮酸饮食在延缓CKD病程进展中的作用是否要优于单纯低蛋白饮食及其具体机制。考虑到氧化应激、炎症在CKD肾纤维化中的作用,本研究的目的在于：明确α酮酸加低蛋白饮食是否较单纯低蛋白饮食可更好地延缓CKD大鼠肾损害进展,减轻氧化应激、和炎症在其中的作用,此外,我们还将进一步探讨KLF15在肾纤维化进展中的作用和机制。为此,我们首先建立5／6肾切除SD大鼠CKD模型,对照组大鼠行假手术(Control,n=12),手术组大鼠分别给予正常蛋白饮食(NPD, n=15)、低蛋白饮食(LPD, n=15)和低蛋白饮食加α-酮酸(LPD+KA, n=15),干预6个月留取血、尿标本后处死大鼠,进行血、尿生化检测；留取肾组织包埋切片,进行Masson染色、电镜、I型胶原和纤维连接蛋白免疫组织化学检测；提取肾组织总RNA,进行Real-time PCR检测TGF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白的表达。结果显示,血尿素氮、尿蛋白、Masson染色病理评分、电镜、胶原染色和纤维化相关的Real-time PCR均显示：与对照组相比,NPD组出现明显的肾功能恶化,LPD较NPD可改善病情进展,而LPD+KA对肾功能的保护作用较LPD更明显(P﹤0.05)。LPD组出现低体重、低血清白蛋白等营养不良的表现,而LPD+KA组未出现明显的营养不良(P﹤0.05)。由于已有研究证实,蛋白营养不良可致组织氧化应激和炎症水平的增加,而氧化应激和炎症是CKD肾纤维化的发生和进展的重要因素,因此,低蛋白加α酮酸饮食较单纯低蛋白饮食更好地减缓肾损害进展,其作用可能与改善营养不良,减少氧化应激和炎症反应有关。为进一步证实氧化应激和炎症在低蛋白加α酮酸饮食在延缓CKD病程进展中的作用,我们进一步检测了各组的氧化应激和炎症的相关指标。将上述大鼠肾组织行组织匀浆检测SOD、MDA,提取总蛋白行oxybolt检测蛋白氧化水平,同时组织切片进行硝基化酪氨酸和CD68免疫组织化学检测。此外还提取肾组织总RNA,采用Real-time PCR检测TNF-α, MCP-1、RANTES和CXCL-1的mRNA表达。结果显示,LPD组和LPD+KA组氧化应激(MDA、硝基化酪氨酸、oxybolt)和炎症(CD68、TNF-α、MCP-1、RANTES、CXCL-1)相关指标较NPD组显著改善,同时,LPD+KA组相关指标也显著好于LPD组(P﹤0.05)。这些结果表明,低蛋白加α酮酸饮食通过减轻氧化应激和炎症反应而减缓CKD肾损害进展。随后,我们研究了KLF15在肾纤维化中的作用。首先通过对上述大鼠肾组织的免疫荧光和Real-time PCR检测发现,KLF15主要在对照组肾组织的系膜细胞和间质成纤维细胞中表达,5／6肾切除后表达显著下降,予以低蛋白和低蛋白加α酮酸饮食可使其表达增加,且LPD+KA组较LPD组增加更为显著(P﹤0.05)。体外实验中我们采用TGF-β1 TNF-α和H202干预大鼠系膜细胞(RMCs),提取总RNA行Real-timePCR检测发现干预后KLF15表达降低(P﹤0.05)；同时通过对TNFR1-/-小鼠系膜细胞及NF-κB基因敲除的RelA-/-小鼠胚肾间质成纤维细胞(MEF)进行TNF-α干预,Real-time PCR检测发现TNF-a通过TNF受体1和NF-κB途径减少KLF15表达。为进一步研究KLF15与纤维化的关系,我们将KLF15质粒瞬时转染人胚肾细胞(HEK293)和RMCs细胞,提取总RNA行Real-time PCR和提取细胞蛋白及上清行ELISA检测,结果显示过表达KLF15可显著减少HEK293和RMCs细胞纤维连接蛋白和IV型胶原的表达(P﹤0.05)。此部分结果表明KLF15参与调控肾纤维化进程,饮食干预可通过影响KLF15表达而延缓CKD进展。总之,本研究发现α酮酸加低蛋白饮食较单纯低蛋白饮食可显著地延缓CKD大鼠肾损害进展,其作用与降低残余肾组织的氧化应激和炎症反应有关。KLF15表达受氧化应激、炎症等多种因素影响,并参与调控CKD肾纤维化进程,饮食干预可通过影响KLF15表达而延缓肾损害进展。
【关键词】 慢性肾脏病； Kruppel样因子15； 低蛋白饮食； α酮酸； 氧化应激； 炎症；

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