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硕士论文 五龙鹅IGF-IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究

  • 简介:硕士论文-五龙鹅IGF-IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究,共81页,40089字,摘要,胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like Growth Factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)是胰岛素样生长因,子的重要成员,对机体的生长发育、组织修复、营养代谢、细胞凋亡以及细胞分
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适用专业:动物遗传育种与繁殖
适用年级:大学
论文编号:198496

论文简介:
硕士论文-五龙鹅IGF-IcDNA及5非翻译区的克隆与表达研究,共81页,40089字
摘要
胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin-like Growth Factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)是胰岛素样生长因
子的重要成员,对机体的生长发育、组织修复、营养代谢、细胞凋亡以及细胞分化等方
面有重要的生物学作用。本试验以五龙鹅为研究对象,克隆了 IGF-Ⅰ基因 cDNA 和 5’
非翻译区部分序列,分析了序列的结构、同源性及蛋白的空间结构,对 IGF-Ⅰ进行了原
核表达,并检测了 IGF-Ⅰ基因在五龙鹅 10 种组织中的表达情况。将为进一步研究 IGF-Ⅰ
基因的结构与功能、 IGF-Ⅰ基因对五龙鹅生长发育的调控以及其与生产性能、经济性
状之间的关系提供理论依据。结果如下:
1
根据鸡(M32791)、鸭(AB061721)等的 IGF-Ⅰ基因保守序列设计引物,运用
RT-PCR 法从五龙鹅肝脏总 RNA 中克隆了 562bp 的 IGF-Ⅰ基因 cDNA 部分序列
(GenBank 登录号为 DQ662932),其中包括 462bp 的完整编码区。五龙鹅 IGF-Ⅰ基因
编码 153 个氨基酸,成熟肽分子量为 7743.8 Daltons,等电点 pI 为 7.78;在第 36~39
个氨基酸处存在一个较强的疏水区;在第 37~116 个氨基酸处存在一个蛋白质超家族;
56.5 %的 IGF-Ⅰ蛋白可能存在于细胞核;蛋白的空间结构主要有 3 个 α 螺旋组成。序列
与鸭、鸡、火鸡、鸵鸟、鹌鹑的氨基酸同源性分别为 100.0%、99.3%、98%、99.3%、
98.7%,进化关系与鸭最近。
2
根据鸡的序列(M74176),并参照 Kansaku 发表的鸭的 5’非翻译区序列设计兼
并引物,从五龙鹅基因组 DNA 中克隆了 796bp 的 5’非翻译区部分序列(GenBank 登录
号为 DQ988932)。获得的序列与鸭相比有 4 处碱基缺失和 7 处碱基插入,同源性为 98.1
%;与鸡相比有 4 处碱基缺失和 3 处碱基插入,同源性为 93.0%;共有 5 种常见的限制
性内切酶的酶切位点 9 处。
3
根据已测得的五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的序列(DQ662932)设计引物,克隆了表达
IGF-Ⅰ基因成熟蛋白部分的 IGF-Ⅰm 序列 228bp。将此片段插入到 pET-32a 质粒中,构
建重组质粒 pET-IGF-Ⅰm,经 PCR 和酶切鉴定为阳性后,转化 E. coli. BL21,经
1.0mM IPTG 25℃诱导 4h,目的基因的表达量较高。SDS-PAGE 电泳显示表达产物分子
量约为 28KD, Western 印迹试验进一步表明,表达的蛋白为目的蛋白。
4
根据已测得的五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的保守区序列设计引物,提取五龙鹅心、脾、
肝、肺、肾、胸肌、腿肌、睾丸、脂肪、脑 10 种组织的总 RNA,建立了利用 Real-time PCR
技术检测组织中 IGF-Ⅰ基因表达量的方法。最佳反应条件为:SYBR Green Ⅰ终浓度为
1×,退火温度为 59℃,此时,熔解曲线显示单峰且峰值单一。五龙鹅 IGF-Ⅰ基因在各
组织中的表达量的关系为:肝>脑>脾>腿肌>胸肌>肺>心>睾丸>脂肪>肾。
关键词:五龙鹅;胰岛素样生长因子-Ⅰ; 基因克隆; 原核表达; 组织表达
目录
中文摘要………………1
英文摘要………………3
英文缩写词表…………5
前言6
文献综述………………7
第一章 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 cDNA 序列的克隆与分析………17
1.1 试验材料与方法…17
1.1.1 试验材料………17
1.1.2 试验方法………19
1.2 结果与分析………24
1.2.1 五龙鹅肝脏总 RNA 的提取…………24
1.2.2 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 cDNA 的扩增…25
1.2.3 扩增条件的优化25
1.2.4 目的片段的转化25
1.2.5 质粒 DNA 的 PCR 扩增检测 ………26
1.2.6 重组质粒的序列测定………………26
1.2.7 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的生物信息学分析…………………26
1.3 讨论……………32
1.4 小结……………33
第二章 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 5’非翻译区部分序列的克隆与分析…………………34
2.1 试验材料与方法…34
2.1.1 试验材料………34
2.1.2 试验方法………34
2.2 结果与分析………35
2.2.1 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 5’非翻译区部分序列的 PCR 扩增与鉴定………………35
2.2.2 重组质粒的 PCR 鉴定………………35
2.2.3 重组质粒测序结果…………………35
2.2.4 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因 5’非翻译区部分序列测序结果分析…………………36
2.3 讨论………………38
2.4 小结………………39
第三章 五龙鹅 IGF-Ⅰ基因的原核表达…40
3.1 试验材料与方法 40
3.1.1 试验材料………40
3.1.2 试验方法………41
3.2 结果与分析………45
3.2.1 RT-PCR 扩增产物的电泳结果………45
3.2.2 重组质粒 pET-IGF-Ⅰm 的鉴定……46
3.2.3 pET-IGF-Ⅰm 的诱导表达及表达条件的优化 …………47
3.2.4 表达产物的 Western 印迹分析 49
3.3 讨论………………49
3.4 小结………………50
第四章 组织中 IGF-Ⅰ基因的表达量检测 …………………51
4.1 试验材料与方法…51
4.1.1 试验材料………51
4.1.2 试验方法………51
4.2 结果与分析………53
4.2.1 组织中 RNA 提取结果………………53
4.2.2 标准曲线的制作53
4.2.3 IGF-Ⅰ基因在组织中的表达量检测54
4.3 讨论………………56
4.4 小结………………57
全文结论……………58
参考文献………………59
附录64
致谢68
攻读硕士期间发表的论文…………………69


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