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硕士论文 马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备

  • 简介:硕士论文-马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备,共71页,35063字,摘要,本研究的目的是构建马铃薯 S 病毒外壳蛋白基因的原核表达载体,使其在大肠杆,菌中高效表达,用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清,为进一步制备马铃
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适用专业:作物遗传育种
适用年级:大学
论文编号:198056

论文简介:
硕士论文-马铃薯S病毒外壳蛋白的原核表达及其抗血清的制备,共71页,35063字
摘要
本研究的目的是构建马铃薯 S 病毒外壳蛋白基因的原核表达载体,使其在大肠杆
菌中高效表达,用表达的融合蛋白作为抗原制备抗血清,为进一步制备马铃薯 S 病毒
的 ELISA 检测试剂盒打基础。
用 PVS-cp 基因的上、下游引物及 pGEM-pvs 模板进行 PCR 扩增,琼脂糖凝胶电泳
显示扩增产物为一条分子量约为 890 bp 的特异条带。用 Ultrafree-DA 试剂盒一步离
心法回收 890 bp 的特异扩增片段,然后与 T 表达载体 pBAD/Thio 连接,重组质粒转
化受体菌 TOP10。经氨苄青霉素抗性筛选、质粒电泳检测、PCR 扩增 及 SphI 与 PstI
限制性内切酶的单酶切和双酶切鉴定,筛选到了阳性克隆,相应的重组质粒被命名为
pBAD-pvs。单独使用基因的引物或混合使用基因及载体的引物进行 PCR 检测,获得了
目的基因正向插入表达载体的目的克隆,对应的重组质粒命名为 pBAD-pvs+。
重组质粒 pBAD-pvs+中外源基因是受阿拉伯糖启动子控制表达的。在 42℃,TOP10
(pBAD-pvs+)用 2%阿拉伯糖诱导培养 4 小时后,SDS-PAGE 凝胶电泳显示表达产物
中有一条分子量为 46 KDa 的特异性蛋白条带,其大小与预期的融合蛋白相符,该蛋
白在总蛋白中的含量为 20.22%。在硝酸纤维素膜上进行 Western blotting 分析,结
果显示该融合蛋白与 PVS-IgG 有反应,形成明显的杂交带,表明该融合蛋白是 PVS-cp
嵌合基因正确表达的产物。
用溶菌酶破碎菌体,提取总蛋白,SDS-PAGE 显示表达的融合蛋白主要以包涵体
的形式存在。经 4 M 尿素洗涤后的包涵体蛋白,用超纯水 4℃过夜溶解,SDS-PAGE
显示得到了只含有该融合蛋白的水溶液,即建立了纯化该融合蛋白比较简便的方法。
经洗涤后的包涵体蛋白用 6 M 尿素溶解,在氧化型和还原型谷胱甘肽存在的条件下复
性,电泳显示得到了该融合蛋白纯度较高的水溶液。两种途径获得的蛋白溶液经浓缩
透析后作为制备抗血清的抗原。
除采用上述两种蛋白溶液外,含目的蛋白的 SDS-PAGE 胶条经液氮研磨后的粉末
也作为抗原。三种抗原同时免疫家兔,制备出了三种抗血清。琼脂糖双向扩散检测显
示,三种来源的抗血清与抗原均能形成明显的沉淀线,其中用研磨后的粉末作抗原得
到的抗血清效价为 1:256,其它两种抗血清的效价为 1:128。结果显示获得了目的
蛋白的特异性抗血清,大肠杆菌表达的该融合蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。
关键词: 马铃薯 S 病毒;外壳蛋白基因;原核表达;融合蛋白;抗血清制备
目录
致谢…ⅰ
中文摘要………………ⅱ
英文摘要………………ⅳ
论文正文
一 引言………………1
二 文献综述…………3
马铃薯病害………3
1.1 马铃薯细菌与真菌病害……………3
1.2 马铃薯病毒病害及其病毒的研究进展3
1.2.1 马铃薯 X 病毒病及病毒……………4
1.2.2 马铃薯 Y 病毒和 A 病毒………4
1.2.3 马铃薯卷叶病毒…………………4
1.2.4 马铃薯 S 病毒…………………5
马铃薯抗病毒途径及抗病毒育种……6
2.1 马铃薯抗病毒途径………………6
2.2 马铃薯抗病毒病育种……………7
马铃薯抗病毒基因工程研究进展……7
3.1 病毒基因组编码蛋白介导的抗性7
3.2 RNA 介导的抗性…………………8
3.3 核酶介导的抗性…………………9
3.4 植物抗性基因介导的抗性………9
马铃薯脱毒与病毒检测方法…………9
4.1 马铃薯脱毒与快繁技术研究进展9
4.2 马铃薯病毒的检测………………10
4.2.1 指示植物法…………………11
4.2.2 电镜鉴定法…………………11
4.2.3 分子生物学检测方法………11
4.2.4、免疫学鉴定方法……………13
三 材料和方法………17
材料………………17
1.1 菌种、质粒及载体……………… 17
1.2 酶与试剂…… 17
1.3 LB 培养基……17
方法………………17
2.1 引物设计和合成…………………17
2.2 重组质粒 pGEM-pvs 转化 DH5α17
2.2.1 含氨苄青霉素平板的制备…17
2.2.2 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备(CaCl2 法)17
2.2.3 大肠杆菌 DH5α的转化……18
2.2.4 质粒小量提取(碱裂解法)18
2.3 PVS-cp 基因的 PCR 扩增…………19
2.4 PCR 产物的回收(Ultrafree-DA 法)…………………19
2.5 PVS-cp 基因表达载体的构建……19
2.5.1 PCR 产物(目的基因)与载体的 T-A 连接………19
2.5.2 大肠杆菌 TOP10 的转化……20
2.5.3 阳性克隆的筛选与鉴定……20
2.6 PVS-cp 基因原核表达的诱导……22
2.7 表达蛋白的鉴定…………………22
2.7.1 SDS-PAGE 鉴定………………22
2.7.2 Western blotting 检测…………23
2.8 目的蛋白的提取纯化……………24
2.8.1 细菌总蛋白的提取…………25
2.8.2 包涵体蛋白的洗涤…………25
2.8.3 包涵体蛋白的溶解和复性…25
2.8.4 复性后蛋白的透析浓缩……25
2.8.5、蛋白含量的测定…………26
2.9 抗血清的制备26
2.10 抗血清中 IgG 的纯化…………………27
2.11 抗血清效价测定…………………27
结果与分析……29
PVS-cp 原核表达载体的构建………29
目的蛋白的诱导与鉴定……………30
蛋白的提取与纯化…………………3 4
抗血清的制备…36
讨论………… 3 9
表达载体的选择3 9
PVS-cp 表达载体的构建……………40
2.1 PCR 扩增参数的优化……………40
2.2 T-A 克隆……40
2.3 阳性克隆的鉴定…………………41
3 PVS-cp 的原核表达41
4 目的蛋白的提取与纯化………………42
5 抗血清制备………42
参考文献………45
缩略语表…………………55
附录:溶液配制……57


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