论文简介：
硕士论文-水貂犬瘟热病毒的分离鉴定及其F基因的原核表达，共77页，37114字
摘要
1. 取一发病水貂的肝、脾、脑等组织研磨后用 Vero 和 BHK 细胞分离病毒，2-3 代后
细胞产生了明显的 CPE，电镜检查发现了典型的副粘病毒样粒子，大小约 150nm。IFA
试验和 RT-PCR 检测均为阳性，证明分离毒是一株犬瘟热病毒。进一步研究显示：该
毒株的 TCID50 为 10-4.87，对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性。分离
株病毒对乙醚、氯仿敏感，不耐酸、不耐热，病毒的核酸型为 RNA。将 PCR 得到的
部分 F 基因克隆到 pMD18-T 载体上进行测序，将其与疫苗株 Onderstepoort、国外水
貂分离株 1493-89 进行序列比较。结果显示水貂分离株与上述两株的核苷酸同源性分
别为 98.6%、93.2%，氨基酸同源性为 98.0%、95.9%。另外，从一狐狸犬瘟热疑似病
料组织中直接提取核酸，进行 RT-PCR 扩增，结果得到与预期扩增片段相符的核酸电
泳带。经克隆后测序显示狐狸 CDV 与疫苗株 Onderstepoort、1493-89 的核苷酸同源
性分别为 98.6%、94.6%，氨基酸同源性为 98.0%、94.9%；与水貂分离株核苷酸同源
性为 98.0%，氨基酸同源性为 95.9%。
2. 用试验一的针对 CDV 的 F 基因保守区设计的引物 F、R，分别以阳性长春株和水
貂分离株的 RNA 为模板，建立了 Real-time PCR 方法来检测 CDV，确定特异性产物
的 Tm 值。试验表明：阳性株和水貂分离株有相同的 Tm 值（95.5℃），将模板稀释
106 仍能检测到。以第一部分的 pMD18-T-F 质粒为定量 PCR 的标准品模板进行荧光
PCR 扩增，通过对反应体系和反应条件进行筛选和优化，最终建立了 CDV 检测的标
准曲线：Y=-3.448X+47.17，相关系数为 1.000，PCR 扩增效率为 95.0%。目前国内未
见将 Real-time PCR 应用于 CD 检测的报道。
3. 以从水貂分离株中提取的 RNA 为模板，经 RT-PCR 扩增获得一约 1000bp 的 F 基
因片段。将此片段插入到 pET-32a 质粒中，构建了重组质粒 pET-32a-F，重组质粒经
PCR 和酶切鉴定为阳性后，转化 E.coli BL21（DE3）中，经 1.0mM IPTG 在 30℃的
条件下诱导，目的基因获得了高效表达。SDS-PAGE 电泳显示表达产物分子量约为
55KD，大小与预期相符；Western Blotting 试验进一步证实，该基因获得了正确表达。
使用 His-Bind Resins 纯化系统对表达产物进行纯化，得到了较纯的目的蛋白。
关键词：犬瘟热；水貂；分离；鉴定；Real-time PCR；原核表达
目录
前言………1
中文摘要…3
英文摘要…4
第一部分 文献综述………… 6
1.CDV 基因组结构和功能 …6
2.病毒生物学特性……………9
3.CDV 的感染机制与免疫机制 …………………11
4.CDV 诊断技术的研究 ……12
5.疫苗的研制……………13
第二部分 试验内容………16
1.水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定………………16
1.1 材料…………………18
1.2 方法…………………18
1.3 结果…………………22
1.4 讨论………………… 26
2. Real-time PCR 方法检测 CDV 的建立……29
2.1 材料
2.2 方法
2.3 结果
2.4 讨论
3.分离株的 F 基因的原核表达36
3.1 材料 36
3.2 方法 37
3.3 结果 42
3.4 讨论 50
参考文献 51
附录 ……61
全文总结 65
致谢 ……66

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