论文简介：
硕士论文-甘薯二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因的克隆与功能分析，共66页，33423字
摘 要
花青素是自然界分布最广，种类最丰富的色素之一，在植物、藻类及蓝细菌中都有
重要的生理功能。紫心甘薯因富含花青素，有极强的抗氧化、抑制癌肿及延缓衰老的功
能，在食品、医药和化妆品行业也有着巨大应用潜力，其花青素合成酶关键基因的研究
是目前最受关注的研究领域之一。本研究分析了不同基因型紫甘薯在不同生育期花青素
含量的变化；同一基因型甘薯在遮荫、地膜覆盖处理后花青素含量的变化；克隆了花青
素合成酶关键基因 DFR（ibDFR）的全长 cDNA，并利用半定量 RT-PCR 方法分析了 ibDFR
在不同处理下的 mRNA 表达情况，结果具体如下：
1. 济薯 18 的花青素含量在生育期前期较低，35-65d 间增加迅速，以后均维持在比较稳
定的水平，变化很小；通过遮荫进行弱光处理后，花青素的含量明显降低；用地膜覆盖
处理后，花青素的含量增加明显。
2. 根据其它作物的二氢黄酮醇 4-还原酶（DFR）基因的保守序列设计引物，利用 RT-PCR
方法从甘薯块根中分离出花青素合成相关基因 DFR 基因，并定名为 ibDFR。该基因在
基因库的登录号为：EU360845，全长 1232bp，编码 398aa。氨基酸序列分析表明，与牵
牛相似系数达 85% ，与烟草的相似系数达 67 %，与马铃薯的相似系数达 75%。将 ibDFR
连接到原核表达载体 pET30a(+)中，检测其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE 实验结果
表明 ibDFR 蛋白质分子量大小与推算一致，能在大肠杆菌中转录表达。
3. 采用半定量 RT-PCR 方法，分析 ibDFR 的 mRNA 在济薯 18 不同生育期的表达情况及
遮荫、地膜覆盖处理后的表达差异。结果表明：ibDFR 的表达水平与不同处理条件下花
青素的含量变动趋于一致。
关键词
甘薯 遮荫 地膜覆盖 花青素 DFR 克隆 表达分析
目 录
中文摘要. Ⅰ
英文摘要. Ⅱ
符号及缩略词........ Ⅳ
1.文献综述 1
1.1 花青素的种类、结构及理化特性.. 1
1.2 花青素合成途径 2
1.3 花青素的生理功能........... 2
1.3.1 抗氧化活性..... 2
1.3.2 抗突变............. 2
1.3.3 预防心脑血管疾病,保护肝脏...... 3
1.3.4 其他.. 3
1.4 植物类花青素合成酶关键性基因的研究进展 ........... 4
1.4.1 苯丙氨酸脱氨酶(PAL, phenylalanine ammonialyase).............. 4
1.4.2 查耳酮合成酶（CHS，chalcone synthase） ............ 4
1.4.3 查耳酮异构酶(CHI,chalcone-flavanone isomerase) .. 5
1.4.4 黄烷酮-3-羟化酶(F3H, flavanone 3-hydroxylase) ..... 5
1.4.5 二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR, dihydroflavonol-4-reductase) ..... 6
1.4.7 类黄酮-3-O-葡糖基转移酶 .......... 7
1.4.8 修饰花色素苷的其它酶 7
1.5 植物花青素生物合成过程中的调控基因 ..... 7
1.6 植物花青素发育过程中的影响因子............. 9
1.6.1 光照.. 9
1.6.2 糖类.. 9
1.6.3 激素.. 9
1.6.4 高花青素含量新品种选育......... 10
1.7 花青素合成关键酶基因的应用.... 10
1.7.1 改变花色....... 10
1.7.2 有望创造雄性不育植株............. 11
1.8 本研究的目的和意义..... 11
2. 不同处理对紫心甘薯花青素含量的影响 .... 14
2.1 材料与方法..... 14
2.1.1 供试材料...... 14
2.1.2 试验设计...... 14
1.1.2.1 甘薯不同生育期间花青素含量的实验设计 ........ 14
2.1.2.2 遮荫对同一基因型甘薯花青素含量影响的实验设计 ....... 15
2.1.2.3 地膜覆盖对同一基因型甘薯花青素含量影响的实验设计 .............. 15
2.1.3 取样方法...... 15
2.1.4 块根花青素含量的测定............. 15
2.1.5 数据处理与分析......... 16
2.2．结果分析....... 16
2.2.1．紫心甘薯不同生育期间花青素含量变化动态 .... 16
2.2.2 遮荫对块根花青素含量、积累过程的影响 ........... 18
2.2.2.1 花青素含量 18
2.2.2.2 花青素积累过程...... 19
2.2.3 覆膜对块根花青素含量的影响. 20
2.3．小结 21
3.甘薯花青素合成关键酶基因 DFR 的克隆与功能分析 .............. 22
3.1. 实验材料........ 22
3.1.1 植物材料...... 22
3.1.2 取样方法....... 22
3.1.3 试剂与试剂盒.............. 23
3.1.4 常用缓冲液、试剂和培养基.... 23
3.1.5 PCR 引物 ...... 23
3.2．实验方法....... 23
3.2.1 基因克隆....... 24
3.2.1.1 甘薯总 RNA 的提取 24
2.2.1.2 总 RNA 定量与完整性检测 ... 24
3.2.1.3 cDNA 第一链的合成 .............. 24
3.2.1.4 CaCl2 制备感受态细胞............ 25
3.2.1.5 PCR 扩增条件 .......... 25
3.2.1.6 目的片段的回收...... 26
3.2.1.7 目的片段与载体的连接......... 27
3.2.1.8 目的片段的转化及克隆鉴定. 27
3.2.1.9 阳性克隆的 PCR 检测 ............ 28
3.2.1.10 质粒的提取............. 28
3.2.1.11 序列测定.. 28
2.2.2.1 原核表达载体的构建.............. 28
3.2.2.2 诱导表达.... 29
3.2.3ibDFR 在济薯 18 号内不同处理对其表达的影响 .. 29
3.2.3 生物信息学分析......... 29
3.3．结果与分析... 30
3.3.1 甘薯块根总 RNA 的提取 .......... 30
3.3.2 甘薯 DFR 基因的克隆 30
3.3.3 甘薯 ibDFR 的氨基酸序列特征分析 ....... 31
3.3.4 DFR 基因的生物进化树分析 .... 33
3.3.5 甘薯 ibDFR 基因在大肠杆菌中的表达 ... 35
3.3.6 济薯 18 在不同处理后对 ibDFR 表达的影响 ........ 35
3.3.6.1 济薯 18 在不同生育期对 ibDFR 的表达影响 ..... 35
3.3.6.2 遮荫处理对济薯 18 ibDFR 的表达影响 .............. 36
3.3.6.3 地膜覆盖对济薯 18 ibDFR 的表达影响 .............. 37
4. 讨
论 38
4.1 二氢黄酮醇一 4 一还原酶的特性 38
4.2 不同生育期和花青素含量的关系 39
4.3 遮荫和花青素合成相关基因的关系........... 39
全文结论. 41
参考文献. 42
附录......... 46
致谢......... 48

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• 硕士论文-甘薯二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）基因的克隆与功能分析
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