论文简介：
硕士论文-猪蓝耳病病毒NSP2基因主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立，共90页，47017字
摘 要
猪 蓝 耳 病 的 病 原 是 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 (porcine reproductive and
respiratory
syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员。该病以
母猪流产、死胎和木乃伊胎以及各种年龄猪的呼吸道疾病为特征，可通过胎盘、排泄物、
空气等多种途径传播。2006 年该病以猪表现“无名高热”的形式在我国大流行，给我国
养猪业造成了巨大的经济损失，因此，建立一种快速高效的诊断方法对 PRRSV 的检测及
预防尤为重要。
本文从 HP-PRRSV（JX0601）株细胞毒提取总 RNA，根据 GenBank 上的参考序列设计
了一对扩增 HP-PRRSV 的 NSP2 基因主要抗原区的特异性引物，在引物的上下游引物分别
带有 NcoⅠ、SalⅠ酶切位点。通过 RT-PCR 获得长约 485bp 的目的片段，将其克隆到 pGEM-T
Easy 载体，获得重组质粒 pGEM-dNSP2。
用相同的限制性内切酶酶切阳性质粒pGEM-dNSP2 和表达载体pET-32a后构建重组表
达载体pET-dNSP2，转化宿主菌BL21(DE3)，经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序证
明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体。用IPTG诱导重组载体的表达，收集菌液进
行SDS-PAGE电泳，原核表达产物大小约为 38.3KDa。进一步优化IPTG诱导浓度、培养时
间和温度等条件，最后确定以 37 ℃培养至OD600达 0.6 左右，加入IPTG至终浓度为
1mmol/L，再以 37℃继续培养 5h，这样的培养条件下表达量最大，经分析表达蛋白量约
占菌体蛋白的 40.3%。表达产物经Western blot分析，能被PRRSV阳性血清所识别。试验
结果表明高致病性PRRSV（JX0601）NSP2 蛋白主要抗原区在大肠杆菌中高效表达且表达
产物具有抗原性。
目的蛋白经大量诱导表达，上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE，证明重组蛋白以可溶性
形式存在于超生裂解液上清中，用镍柱亲和层析法从上清中纯化目的蛋白。以纯化后的
目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板，初步建立了检测 PRRSV 抗体的间接 ELISA 方
法。试验表明：抗原的最适包被浓度为 20μg/mL，血清最适稀释度为 1:160；最适封闭
液为 1%BSA，封闭时间为 37℃ 1h，最佳血清及二抗反应条件及时间均为 37℃ 1h；HRP-
兔抗猪 IgG 的最适工作浓度为 1：5000；底物显色液的最佳反应时间为 15min；统计学
分析后确定阴阳性的临界值为 0.35。通过特异性试验、重复性试验、符合性试验及对临
床样品检测的结果显示，该方法特异、敏感、快速和操作简便。这为进一步开发 PRRSV 抗
体检测试剂盒奠定了基础。
关键词： PRRSV；NSP2 蛋白；原核表达；间接 ELISA
目录
摘 要........1
ABSTRACT........3
英文缩写词......5
文献综述.......6
1 综述前言........6
2 PRRSV的生物学特性..6
3 PRRSV分子生物学研究进展8
4 PRRSV的遗传变异........13
5 PRRSV致病机理的研究进展......16
6 PRRSV免疫学研究进展.......17
7 PRRSV流行病学的研究进展........19
8 PRRSV诊断技术的研究进展21
9 研究的目的意义 .....24
试验一 高致病性猪蓝耳病病毒NSP2基因主要抗原区域在大肠杆菌中的表达.......25
1 材料与方法..25
1.1 材料.25
1.1.1病毒和阳性血清......25
1.1.2载体和菌株...25
1.1.3主要仪器与设备...25
1.1.4 主要试剂与工具酶.........26
1.1.5 主要溶液方...26
1.2 方法...29
1.2.1 RT-PCR.........29
1.2.2 PCR扩增产物的凝胶电泳 ......31
1.2.3 目的基因的回收....31
1.2.4 目的基因与载体的连接..31
1.2.5 感受态细胞的制备........32
1.2.6 连接产物的转化.33
1.2.7 碱裂解法小量制备质粒 DNA 33
1.2.8 重组质粒鉴定 ...33
1.2.9 目的基因序列测定及分析 ...35
1.2.10 原核表达载体的构建..35
1.2.11 重组质粒的诱导表达.....38
1.2.12 最佳诱导条件的确定 .38
1.2.13 表达产物的检测 ....38
2 结果39
2.1 目的基因片段的扩增.........40
2.2 重组质粒 pGEM-dNSP2的鉴定 40
2.3 重组表达质粒pET-dNSP2的鉴定....41
2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测..42
2.5 表达条件的优化....42
2.6 Western blot 分析...44
3 讨论 ...45
3.1 目的基因片段的选择与扩增.45
3.2 pET-dNSP2重组表达载体的构建45
3.3 关于重组蛋白的表达....45
3.4 表达条件的优化........46
3.5 重组蛋白的表达量及抗原性鉴定.........47
试验二 PRRSV间接 ELISA检测方法的初步建立 ........48
1 材料与方法........48
1.1 材料......48
1.1.1 主要试剂及血清样品.......48
1.1.2 主要仪器设备.........48
1.1.3 用于蛋白纯化溶液的配制.........48
1.1.4 ELISA 所用溶液.......49
1.2 方法........50
1.2.1 重组蛋白的大量诱导表达........50
1.2.2目的蛋白存在情况检测....50
1.2.3 镍柱的处理..50
1.2.4 镍柱的再生..50
1.2.5 目的蛋白的纯化....51
1.2.6 纯化蛋白的浓缩...51
1.2.7 重组蛋白浓度的测定及抗原性的测定 .......52
1.2.8 重组蛋白间接ELISA检测方法的初步研究52
2 结果......54
2.1 重组蛋白的制备及纯化......54
2.2 纯化蛋白浓度测定........55
2.3 间接 ELISA 方法的初步建立 ...56
3 讨论.........63
3.1 目的蛋白存在形式检测...63
3.2 重组蛋白的纯化.....63
3.3 间接ELISA方法的建立........63
3.4 PRRSV NSP2间接ELISA方法建立的意义 65
全文总结...66
参考文献...67
致谢..79

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