论文简介：
硕士论文-大豆生物钟基因GmLCL1/2和GmTOC1的克隆及其功能分析，共78页，40971字
摘 要
生物钟基因普遍存在于生物界，其作用在于产生和控制昼夜节律的运转。LHY、CCA1
和 TOC1 是生物钟的关键基因。生物钟基因及其编码的蛋白质组成反馈回路，维持振荡
系统持续进行并与环境周期保持同步。
本研究以大豆品种垦农 18 为材料，依据同源检索得到的 EST 片段，从叶片 cDNA
中克隆了三个基因，命名为 GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1。GmLCL1、GmLCL2 和
GmTOC1 基因 cDNA 全长分别为 2250 bp、 2247 bp 和 1677 bp，编码 750、749 和 559
个氨基酸。
通过生物信息学分析，GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 与栗属 LHY 、CCA1 和 TOC1
基因，四季豆 LHY 、CCA1 和 TOC1 基因的氨基酸序列具有较高的同源性。在此基础上，
运用 MEGA3 软件成功构建了 GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 的系统进化树，并且通过
网络服务器结合 Spdbv 软件对 GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 蛋白质结构进行预测，
GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 蛋白结构中含有较多螺旋和卷曲。
将克隆到的 GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 基因，利用 Gateway 技术构建了植物
表达载体 35S::GmLCL1，35S::GmLCL2，35S::GFP: GmLCL1。通过农杆菌转化法将其
分别转化拟南芥，利用 PCR 技术对转基因阳性植株进行分子鉴定。结果表明 GmLCL1
和 GmLCL2 已经整合到拟南芥基因组中，为下一步研究基因功能奠定了基础。
为了将 GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 基因沉默来研究其功能，对 GmLCL1、
GmLCL2 和 GmTOC1 基因中的 RNAi 片段进行克隆，并利用 Gateway 技术构建了植物表
达载体 RNAi-GmLCL1， RNAi-GmLCL2 和 RNAi-GmTOC1，其中 RNAi 片段能将目
的基因沉默。然后通过农杆菌转化法将其分别转化了大豆。
通过半定量 PCR 研究了 GmLCL1、 GmLCL2 和 GmTOC1 的生物钟表达模式，结
果表明，这三个基因分别在大豆的单叶和整株中的表达模式相似。GmLCL1 和 GmLCL2
在上午 8 点刚开灯的时候表达量达到高峰，而 GmTOC1 则相反，在下午 4 点关灯后深
夜的表达量最高。并且，表达模式不受光照的影响，符合生物钟成分的基本特性。这种
表达模式与拟南芥等植物生物钟基因的表达模式类似。因此，GmLCL1、GmLCL2 和
GmTOC1 可能是大豆的生物钟基因。
为了从蛋白水平研究 GmLCL2 和 GmTOC1 基因的功能，制备了 GmLCL2 和 GmTOC1
的特异性抗体。经 Gateway 技术中的 LR 反应后，分别将 GmLCL2 和 GmTOC1 基因的
特异性片段克隆到原核表达载体 pDEST-17 中。用重组质粒转化大肠杆菌 BL21Star，并
经 丙 基 β D 硫 代 半 乳 糖 苷 (IPTG) 分 别 诱 导 产 生 了 His-GmLCL2 融 合 蛋 白 和
His-GmTOC1 融合蛋白。以 His 树脂纯化融合蛋白，并将其用于免疫兔子制备抗血清。
抗血清的效价及特异性采用 Westernblot 检测。结果表明，抗体效价为 1:2000。
本研究结果为今后分析和研究 GmLCL1、GmLCL2 和 GmTOC1 基因的功能及其调
节机理奠定了基础。
关键词:
大豆；光周期；生物钟基因；基因克隆；表达模式
目 录
中文摘要……1
英文摘要……3
缩略词………5
前言…………6
1 立题依据…6
2 文献综述…6
2.1 生物钟节律的研究进展 6
2.2 拟南芥中调控开花的机理研究……… 7
2.2.1 光信号感受和输入途径…………… 8
2.2.2 拟南芥的生物钟系统 11
2.2.3 光信号输出途径…… 19
材料与方法…21
1 试验材料…21
1.1 植物材料 21
1.2 菌株材料及载体……… 21
1.3 试剂及仪器设备……… 21
1.4 培养基和溶液的配制… 21
2 试验方法…22
2.1 大豆基因的克隆……… 22
2.1.1 核酸的提取………… 22
2.1.2 反转录反应………… 23
2.1.3 PCR 技术…………… 24
2.1.4 DNA 片段回收纯化… 25
2.1.5 连接反应…………… 26
2.1.6 感受态的制备和转化宿主菌……… 27
2.2 Gateway 技术系统构建载体………… 28
2.3 农杆菌感受态细胞的制备和转化…… 29
2.4 拟南芥的种植和转化… 31
2.5 大豆基因的生物信息学分析………… 32
2.5.1 基因编码蛋白质的结构分析……… 32
2.5.2 基因编码蛋白质进化分析………… 32
2.6 生物钟基因在大豆植株中表达模式的研究………… 33
2.7 抗血清的制备和检测… 34
结果与分析…36
1 大豆生物钟基因的克隆…36
1.1 大豆叶片总 RNA 的提取鉴定……… 36
1.2 大豆基因 cDNA 的克隆 36
2 基因的生物信息学分析…39
2.1 基因间氨基酸的 BLAST 比对……… 39
2.2 基因系统进化树的构建 41
2.3 蛋白三级结构的预测… 43
3 Gateway 技术系统构建载体…………… 43
4 拟南芥转化后代的表型分析……………48
4.1 转基因拟南芥的筛选… 48
4.2 拟南芥转化后代的 PCR 检测……… 48
4.3 拟南芥转化后代的表型分析………… 50
5 基因在大豆植株中发育阶段表达模式的研究………53
6 基因在大豆植株中生物钟表达模式的研究…………53
7 抗血清的制备和检测…56
7.1 抗体特异性片段的克隆 56
7.2 蛋白的诱导…………… 58
7.3 蛋白的纯化…………… 59
讨论………62
结论………64
参考文献… 65
致谢………II

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