论文简介：
硕士论文-花生高频率植株再生体系的建立及其遗传转化研究，共82页，39383字
摘 要
花生（Arachis hypogaea L.）是我国重要的油料作物和经济作物之一，但由于花生
遗传基础狭窄、抗逆性差，易感多种病虫害，尤其是褐斑病、黑斑病、网纹斑病和黄曲
霉病等真菌性病害，严重影响其产量和质量。本论文以广谱抗真菌性的 β-1, 3-葡聚糖酶
基因(BG2)和几丁质酶基因(CH5B)为目的基因进行了花生遗传转化研究，旨在为培育抗
病花生新种质奠定基础。首先以花生胚小叶为外植体，建立了高频率植株再生体系；以
此体系为培养基础对农杆菌介导的遗传转化条件进行了研究，并获得了转基因植株。结
果如下：
1. 以花生品种花育 22 和鲁花 11 成熟种子的胚小叶为外植体，对不定芽诱导和体
细胞胚胎发生及其植株再生条件进行了研究。结果表明：⑴不定芽诱导及植株再生试验
中，MSB5+1mg/L NAA+6mg/L BAP 最有利于不定芽的诱导，花育 22 和鲁花 11 不定芽
诱导率分别达到 95.0%和 93.9%；当转移到 MSB5 +4.0mg/L BAP 培养基上培养，能促使
芽伸长，并获得了较高频率的植株再生。⑵体细胞胚胎发生及植株再生试验中，花育 22
和鲁花 11 在添加 10mg/L 2,4-D 培养基上体细胞胚诱导率均最高,分别为 83.6%和 86.6%；
MSB5 +5μg/L TDZ 较有利于促进体细胞胚萌发和植株再生。(3)在添加 0.5 mg/L NAA 的
MSB5 培养基上，花育 22 的生根率为 67.2%，鲁花 11 为 80.6%。
2 为解决花生组培再生苗及转基因苗驯化移栽成活率低的难题，本试验以花生实生
苗作为砧木，对花生嫁接技术进行了研究。试验结果表明：超净台内无菌嫁接效果较好，
以再生苗或实生苗为接穗进行无菌嫁接，其成活率均达 90%以上，明显高于室内嫁接成
活率（71%-72%）；无菌嫁接时 12-15d 苗龄的砧木效果最好；将无菌嫁接苗在培养基中
培养 3-5d，然后驯化 1-2d，移栽成活率最高，不同花生基因型成活率在 83%-95%；嫁
接苗移栽田间后，其成活率高达 94%，且 100%接穗结果。
3. 以花育 23 和白沙 1016 幼叶为受体材料，对器官发生途径的花生遗传转化条件
进行了优化。农杆菌菌株为 GV3101，质粒为双元表达载体 pCH5B1300，以潮霉素（HB）
作为抗性筛选标记，T-DNA 区有 CH5B 基因。首先进行了 HB 浓度（10，15，20，25，
30mg/L）筛选的试验，结果确定 HB 筛选压为 20 mg/L。研究了在农杆菌悬浮液和共培
养基中分别添加不同浓度的乙酰丁香酮（AS：0，50，100，150μM）对抗性芽诱导的影
响。结果表明，分别在农杆菌侵染和共培养过程中添加 100μM AS 抗性芽诱导率最高，
有利于提高遗传转化效率。将抗性芽转移到 MSB5+4.0mg/L BAP+20mg/L HB+500mg/L
Cb 的培养基上，促使芽伸长，长成小苗。
4 以花育 22 胚小叶为受体材料，对体胚发生途径的花生遗传转化条件进行了研究。
农杆菌菌株为 EHA105，质粒为双元表达载体 pATC940，T-DNA 区含有 BG2 基因，以
Km 作为抗性筛选标记。对适宜的 Km 浓度进行了筛选试验（设计 0，10，20，25，30,40，
50，75mg/L），最终确定 Km 筛选压为 50 mg/L。研究了不同预培养时间（2，4，6 d）、
侵染时间（10，15，20 min）、共培养时间（2，4，6 d）对遗传转化的影响。结果表明，
外植体预培养 4 d，在农杆菌中侵染 15 min，共培养 4 d，然后转移到 MSB5+10mg/L 2, 4-D
+50 mg/L Km+500mg/L Cb 的体胚诱导培养基上培养，抗性体胚诱导率最高，为适宜的
遗传转化条件。
5. 将抗性芽和抗性体胚转移到相应的伸长和萌发培养基上培养，促使其长成小苗。
对抗性植株进行 PCR 检测，扩增出了与目的基因大小相同的条带，表明目的基因已转
入花生。
关键词：花生（A. hypogaea L.）；胚小叶培养；嫁接；遗传转化；农杆菌介导法；
β-1, 3-葡聚糖酶基因（BG2）；几丁质酶基因（CH5B）
目录
摘 要  i
Abstract  iii
缩略词表 .. v
前 言  1
1 立题依据及意义  1
2 文献综述  2
2.1 花生组织培养与植株再生的研究进展. 2
2.1.1 器官发生途径获得再生植株 . 2
2.1.2 胚胎发生途径获得再生植株 . 3
2.2 花生遗传转化研究现状 .. 5
2.2.1 植物基因转化受体系统. 5
2.2.2 花生基因转化方法的研究.... 6
2.2.2.1 农杆菌介导法 . 6
2.2.2.2 基因枪法 7
2.2.2.3 电激法.. 8
2.2.2.4 花粉管通道法 . 8
2.3 β-1,3-葡聚糖酶作用及其研究进展. 9
2.3.1 β-1,3-葡聚糖酶的性质 .... 9
2.3.2 β-1,3-葡聚糖酶在植物抗病中的作用.. 10
2.3.3 转 β-1,3-葡聚糖酶基因研究进展  11
2.4 几丁质酶作用及其研究进展 .. 11
2.4.1 几丁质酶的结构及分类 .... 11
2.4.2 几丁质酶在植物抗病中的作用 ... 12
2.4.3 转几丁质酶基因研究进展 .. 13
材料与方法 .... 15
1 花生胚小叶组织培养及植株再生  15
1.1 植物材料 .. 15
1.2 试验方法 .. 15
1.2.1 基本培养基和培养条件 .... 15
1.2.2 外植体的制备.. 15
1.2.3 不定芽诱导及其植株再生 .. 15
1.2.3.1 不定芽的诱导  15
1.2.3.2 不定芽的伸长及植株再生  16
1.2.4 体细胞胚胎发生及其植株再生 ... 16
1.2.4.1 体细胞胚胎的诱导 . 16
1.2.4.2 体细胞胚萌发及植株再生  16
1.2.5 生根培养. 16
2 花生组培苗嫁接技术的研究 .... 16
2.1 试验材料 .. 16
2.2 试验方法 .. 17
2.2.1 砧木材料的准备  17
2.2.2 接穗的准备.... 17
2.2.3 组培再生苗的获得及接穗准备 ... 17
2.2.4 嫁接方法及驯化移栽 . 17
2.2.5 嫁接苗田间移栽  18
3 农杆菌介导的花生遗传转化研究  18
3.1 试验材料 .. 18
3.1.1 植物材料. 18
3.1.2 菌株和质粒.... 19
3.1.3 培养基 .. 20
3.1.4 试剂配制. 20
3.1.4.1 抗生素的配制  20
3.1.4.2 乙酰丁香酮（AS）的配置  20
3.1.4.3 质粒提取所需试剂 . 21
3.1.4.4 植物基因组 DNA 提取试剂： ... 21
3.1.4.5 DNA 电泳所需试剂： .... 21
3.2 试验方法 .. 21
3.2.1 农杆菌质粒 DNA 的提取 .... 21
3.2.2 表达载体的 PCR 检测 . 22
3.2.3 器官发生途径的花生遗传转化 .... 22
3.2.3.1 HB 筛选浓度的确定. 22
3.2.3.2 侵染用农杆菌菌液的制备  23
3.2.3.3 遗传转化与抗性植株再生  23
3.2.4 体细胞胚发生途径的花生遗传转化  23
3.2.4.1 Km 筛选浓度的确定. 23
3.2.4.2 遗传转化及抗性植株的再生 ... 23
3.2.5 花生基因组 DNA 的提取 .... 24
3.2.6 转化植株的 PCR 检测. 24
结果与分析 .... 26
1.花生胚小叶组织培养植株再生体系的建立... 26
1.1 不定芽诱导及其植株再生 .... 26
1.1.1 不同浓度 NAA 和 BAP 对胚小叶外植体不定芽诱导的影响 .. 26
1.1.2 不同浓度 BAP 对不定芽伸长及植株再生的影响 27
1.2 体细胞胚胎发生及其植株再生  29
1.2.1 不同浓度 2,4-D 对体细胞胚胎诱导的影响 .... 29
1.2.2 体细胞胚萌发及植株再生 .. 30
1.3 再生苗生根. 31
2 花生嫁接技术研究.. 32
2.1 两种嫁接方式的比较 ... 32
2.2 砧木苗龄对嫁接苗成活率的影响 .. 32
2.3 无菌嫁接苗继续无菌培养时间对成活率的影响 . 33
2.4 不同基因型的嫁接结果  33
2.5 组培再生苗的嫁接结果 . 34
2.6 嫁接苗田间生长及结荚结果 . 35
3 农杆菌介导的花生遗传转化的研究 ... 36
3.1 植物表达载体的鉴定 ... 36
3.1.1 农杆菌质粒 DNA 的提取 .... 36
3.1.2 表达载体的 PCR 检测 . 36
3.2 器官发生途径的花生遗传转化  37
3.2.1 潮霉素筛选浓度的确定 .... 37
3.2.2 农杆菌悬浮液中添加 AS 对抗性芽诱导的影响 . 38
3.2.3 共培养基中添加 AS 对抗性芽诱导的影响 39
3.2.4 抗性植株的获得  40
3.2.5 PCR 检测结果 .. 41
3.3 体细胞胚胎发生途径的花生遗传转化  41
3.3.1 Km 筛选浓度的确定 .. 41
3.3.2 不同转化条件对抗性体胚诱导的影响... 42
3.3.2.1 预培养时间的影响 . 42
3.3.2.2 侵染时间的影响 ... 44
3.3.2.3 共培养时间的影响 . 45
3.3.3 抗性植株的获得  46
3.3.4 PCR 检测结果 .. 46
讨 论 .... 48
1 花生胚小叶培养植株再生体系的研究 . 48
1.1 影响器官发生因素的研究 .... 48
1.2 影响胚胎发生因素的研究 .... 48
2 花生组培苗嫁接技术的研究 .... 49
3 农杆菌介导的花生遗传转化影响因素的研究. 50
3.1 HB 和 Km 筛选浓度  50
3.2 器官发生途径遗传转化影响因素的研究... 50
3.3 体胚发生途径遗传转化影响因素的研究... 50
3.3.1 预培养时间的影响 ... 51
3.3.2 侵染时间对转化的影响 .... 51
3.3.3 共培养时间对转化的影响 .. 52
结 论 .... 53
参考文献 . 54
附录：MSB5（MS 无机盐+B5 有机成分）培养基的组成 . 59
致 谢 .... 60

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