论文简介：
硕士论文-深海嗜冷杆菌低温脂肪酶基因的克隆表达、酶的纯化及性质研究，共102页，45714字
摘 要
脂 肪 酶 （ lipases, E.C.3.1.1.3 ）， 全 称 为 三 酰 甘 油 酰 基 水 解 酶 （ triacylglycerol
acylhydrolase），属于 α/β 折叠酶家族，是一类丝氨酸水解酶。它们在非水介质中有较高
的活力和稳定性，所以可以用来催化有机反应，如酯化和转酯化反应。由于低温脂肪酶
在低温条件下（0℃～30℃）具有良好的催化特性，Kcat 值和生理效率（Kcat/Km）高，活
化能低，具有反应条件温和、副产物少，可以节约能源保护环境，因此广泛用于工业生
产，也因此成为国内外酶学研究的热点。
本研究从实验室保存的 80 株筛选于冲绳海槽的菌株中，用三丁酸甘油酯和 Tween 80
筛选出 1 株产低温脂肪酶的菌株，经 16S rRNA 基因序列分析鉴定为嗜冷杆菌，并定名
为 Psychrobacter sp. C18。
考虑到此菌株的低温难培养和产酶量低的缺点，我们对低温脂肪酶基因进行了中温
宿主的克隆与表达研究。采用限制性内切酶 Sau3A I 酶切基因组 DNA，回收 2～7kb 的
DNA 片段，然后与事先经 BamH I 酶切且去磷酸化的质粒载体 pUC19 连接，转化大肠
杆菌 DH5α，以此建立基因组 DNA 文库，采用三丁酸甘油酯平板和蓝白斑筛选相结合
的方法从基因文库中筛选到 2 株阳性克隆命名为 pL1 和 pL2，测序分析表明为同一克隆。
该核苷酸序列包含有完整的阅读框，共 945bp，编码 315 个氨基酸，预测其分子量为
35,028Da，将此序列提交 GenBank，得到登陆号为：GU583649，并定义此脂肪酶基因
为 lipX。该酶包含大多数脂肪酶都存在的以 Ser 为中心的保守序列 GNSMG (GxSxG, x
为任意碱基)，和保守域 HG。以 lipX 的开放阅读框设计引物，使其 C-末端带有 His-tag，
并去掉 N 端信号肽序列，PCR 产物酶切后转化已酶切后的 pET-28a(+)构建表达载体
pET28a(+)/lipXHis，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)。优化表达条件，其最佳表达条件是：37℃
培养至 OD600nm 值为 0.6 时加入终浓度为 0.1 mM 的 IPTG，20℃诱导表达 8 h。用镍柱亲
和层析纯化脂肪酶，最后纯化倍数为 10.7，产量达 59.1%，最终得到酶活为 623.3U/mg
的纯酶。研究其酶学性质发现，该脂肪酶的最适作用温度为 30℃，并且在小于 30℃的
温度范围内稳定，40℃还保持 80%的活力；其最适作用 pH 为 8.0，因此属于碱性低温
脂肪酶；Ca2+，Mg2+，K+，Cu2+对酶有激活作用而 Zn2+，Co2+，Mn2+，Fe3+都对酶活有
抑制作用，其中 Zn2+对脂肪酶活性的抑制作用最大；一定浓度的盐度对脂肪酶有显著激
活作用，非极性的表面活性剂对酶有激活作用，但是极性表面活性剂 SDS 强烈抑制脂
肪酶活力，低浓度的有机溶剂有一定的耐受性，说明此酶可用于有机合成；底物选择实
验结果表明 LipXHis 偏于中长 C 链脂肪酸酯底物。
关键词：嗜冷杆菌；低温脂肪酶；基因组文库；基因表达；重组脂肪酶；深海沉积物
目 录
1 绪 论...... 1
1.1 脂肪酶概述 ...... 1
1.1.1 脂肪酶定义 ... 1
1.1.2 微生物脂肪酶 ............ 1
1.1.3 低温微生物脂肪酶 .... 2
1.2 微生物脂肪酶研究进展 ............ 4
1.2.1 产脂肪酶微生物的筛选 ......... 4
1.2.2 微生物脂肪酶的理化性质 ..... 4
1.2.3 低温微生物脂肪酶的结构特征 .......... 5
1.2.4 低温微生物脂肪酶的固定化 . 6
1.3 分子生物学在低温脂肪酶中的应用 ..... 7
1.3.1 低温脂肪酶基因的克隆 ......... 7
1.3.2 低温脂肪酶基因的表达 ......... 8
1.4 微生物脂肪酶的应用现状与前景 ......... 9
1.4.1 食品加工方面的应用 ........... 10
1.4.2 洗涤剂方面的应用 .. 10
1.4.3 环境修复方面的研究 ........... 11
1.4.4 生产可降解材料 ...... 11
1.4.5 纺织工业的应用 ...... 11
1.4.6 手性化合物合成中的应用 ... 12
1.4.7 化妆品的应用 .......... 12
1.4.8 皮革生产 ..... 12
1.4.9 生物柴油制备方面的应用 ... 12
1.4.10 纸浆和造纸 ............ 13
1.5 冲绳海槽海洋环境 ..... 14
1.6 本研究的目的和意义 . 14
1.7 研究内容 ........ 15
1.8 技术路线 ........ 16
2 产低温脂肪酶菌株的筛选与分子鉴定 .. 17
2.1 实验材料 ........ 17
2.1.1 样品的采集 . 17
2.1.2 培养基及试剂 .......... 17
2.2 实验方法 ........ 18
2.2.1 筛选方法 ..... 18
2.2.2 摇瓶培养 ..... 18
2.2.3 脂肪酶活力的测定 .. 18
2.2.4 对硝基苯酚 (p-NP) 标准曲线的测定及微摩尔消光系数的测定 ...... 19
2.2.5 产脂肪酶菌株的 16S rDNA 分子鉴定 .......... 19
2.2.6 脂肪酶活性中心的 PCR 扩增 .......... 20
2.2.7 产脂肪酶菌株生长曲线及酶活曲线测定 ..... 20
2.3 实验结果 ......... 20
2.3.1 产低温脂肪酶菌株的筛选 ... 20
2.3.2 低温产脂肪酶菌株的 16S rDNA 分子鉴定及系统发育树的构建 ..... 21
2.3.4 脂肪酶活性中心的 PCR 扩增 .......... 22
2.3.5 对硝基酚标准曲线的测定 ... 23
2.3.6 Psychrobacter sp. C18 生长曲线与酶活曲线的测定 . 23
2.4 讨论 ... 24
3 低温脂肪酶基因克隆.... 26
3.1 实验材料 ........ 27
3.1.1. 菌株和质粒  27
3.1.2 工具酶和化学试剂 .. 27
3.1.3 培养基 ......... 27
3.2 染色体 DNA 文库的构建........ 27
3.2.1 菌株 Psychrobacter sp. C18 基因组 DNA 的提取 ...... 27
3.2.2 pUC19 质粒 DNA 的提取..... 28
3.2.3 质粒的去磷酸化 ...... 28
3.2.4 基因组 DNA 的酶切 30
3.2.5 CaCl2 法感受态细胞的制备.. 30
3.2.6 连接反应 ..... 30
3.2.7 连接产物的转化 ...... 31
3.3 阳性克隆的鉴定 ......... 31
3.3.1 提取质粒验证插入片段大小 ............ 31
3.3.2 阳性克隆子的序列测定 ....... 31
3.4 结果与讨论 .... 32
3.4.1 基因组 DNA 的提取 32
3.4.2 基因组 DNA 的酶切 32
3.4.3 质粒载体的制备 ...... 33
3.4.4 基因文库的构建 ...... 34
3.4.5 序列测定和分析 ...... 34
3.4.6 低温脂肪酶基因 lipX 系统发育树分析 ........ 36
3.5 讨论 ... 36
4 低温脂肪酶 LipX 在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化 ....... 38
4.1 材料 .... 38
4.1.1 限制性内切酶、质粒载体和菌株 ..... 38
4.1.2 引物与试剂 . 38
4.1.3 培养基 ......... 39
4.2 实验方法 ........ 39
4.2.1 表达载体 pET-28a (+) /lipXHis 的构建 ........... 39
4.2.2 阳性克隆的鉴定 ...... 43
4.2.3 目的基因的诱导表达 ........... 43
4.2.4 表达条件优化 .......... 43
4.2.5 脂肪酶活力的测定 .. 44
4.2.6 蛋白含量的测定 ...... 44
4.2.7 蛋白分子量的测定 .. 45
4.3 结果与讨论 .... 46
4.3.1 表达载体的构建 ...... 46
4.3.2 表达条件优化 .......... 48
4.3.3 蛋白浓度标准曲线的测定 ... 51
4.4 小结 ... 51
5 嗜低温脂肪酶 LipX 的分离纯化与酶学性质研究 ......... 53
5.1 实验材料 ........ 53
5.1.1 实验菌株 ...... 53
5.1.2 主要试剂 ..... 53
5.1.3 主要试剂的配制 ...... 54
5.2 实验方法 ........ 54
5.2.1 脂肪酶的纯化 .......... 54
5.2.2 脂肪酶 LipXHis 的酶学性质 . 55
5.3 结果与讨论 .... 57
5.3.1 脂肪酶的纯化 .......... 57
5.3.2 脂肪酶 LipXHis 的酶学性质 . 58
5.4 讨论 ... 63
6 低温脂肪酶 LipX 的生物信息学分析 ... 65
6.1 实验材料 ........ 65
6.1.1 实验菌株 ..... 65
6.1.2 生物软件及工具 ...... 65
6.2 结果与讨论 .... 66
6.2.1 低温脂肪酶同源序列分析 ... 66
6.2.2 信号肽序列的预测 ... 67
6.2.3 疏水性分析 . 68
6.2.4 蛋白质一级结构分析 ........... 69
6.2.4 结构域预测与分析 .. 70
6.2.5 脂肪酶二级结构预测 ........... 70
6.2.6 蛋白的同源建模 ...... 72
6.3 小结 ... 74
7 结论与展望.......75
参考文献.. 77
主要实验仪器....... 82
致谢.......... 83
攻读硕士期间发表论文情况......... 84

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